一.PINP ELISA試劑盒【預(yù)期用途】
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析方法，用于定量測定人血清或羊水樣本中I型原膠原N端前肽(PINP)。僅用于科學(xué)研究。

二.PINP ELISA試劑盒【概要說明】
I型膠原的生成是骨形成過程中的一個(gè)重要步驟，它是骨基質(zhì)中的主要有機(jī)成分。I型原膠原氨基端前肽(PINP)來源于膠原合成過程中與膠原同等數(shù)量的1型原膠原分子。在膠原合成中，前肽是從與膠原等分子濃度的前膠原分子N端和C端末裂解下來的。因此，定量測定PINP可測定膠原合成和/或骨形成狀態(tài)。

本試劑盒識(shí)別的人PINP特異性序列，只在骨形成過程中釋放，不與肝纖維化誘導(dǎo)的I型膠原合成交叉，同時(shí)與人的PIINP、PIIINP同源序列交叉反應(yīng)小于5%。

三.PINP ELISA試劑盒檢驗(yàn)原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫方法。利用生物素標(biāo)記的小鼠抗PINP單克隆抗體包被至鏈酶親和素預(yù)包被微孔板的孔內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本加入到微孔后，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗PINP單克隆抗體，然后室溫下孵育1小時(shí)，接著吸出孔內(nèi)液體并洗滌。zui后加入顯色底物(TMB)進(jìn)行顯色。將加入了終止液的混合液體置于酶標(biāo)儀上讀取吸光度，顏色強(qiáng)度與PINP濃度成正比。
【組成成分】
1.Standard A‐標(biāo)準(zhǔn)品A
含有PINP的胎牛血清的凍干粉。
標(biāo)準(zhǔn)品A的濃度為780 ng/ml，每瓶用4.5ml的蒸餾水或去離子水重懸。
2.Streptavidin Coated MTP‐鏈霉親和素預(yù)包被微孔板
孔內(nèi)預(yù)包被鏈酶親和素的微孔板，12×8孔條，包裝于帶干燥劑的鋁箔袋中。
3.Biotinylated P1NP Antibody‐生物素標(biāo)記的抗P1NP抗體
含有生物素標(biāo)記的PINP抗體的蛋白穩(wěn)定劑的磷酸緩沖鹽，每瓶0.2ml。
4.POD Conjugated Antibody‐酶結(jié)合物
含辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠單抗、酶穩(wěn)定劑和防腐劑的磷酸鹽緩沖液，每瓶0.2ml。
5.Substrate Solution‐底物液
含有四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和過氧化氫的溶液，每瓶12 ml。
6.Stopping Solution‐終止液
0.3M 稀硫酸，每瓶12ml。
7.Incubation Buffer‐孵育緩沖液
含蛋白穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液，每瓶30ml。
8.Washing Solution‐洗液
含有吐溫的50×Tris鹽緩沖液，每瓶20ml。
9.Sealing Tape‐封板膜
4張/盒。

四.PINP ELISA試劑盒【儲(chǔ)存條件及有效期】
2‐8°C下保存12個(gè)月。

五.PINP ELISA試劑盒【適用儀器】
適用于具有450nm、650nm波長的所有全自動(dòng)、半自動(dòng)酶標(biāo)儀。

六.PINP ELISA試劑盒【樣本要求】
采用人血清或羊水樣本。樣本收集后應(yīng)盡快分離，長期儲(chǔ)存需置于‐20°C下，避免樣本反復(fù)凍融。整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用相同的樣本類型。

七.PINP ELISA試劑盒【檢驗(yàn)方法】
1.自備材料：
1)可移取10μL，20μL和100μL的高精度移液器
2)可移取100μL的高精度多道移液器
3)酶標(biāo)板振蕩器
4)自動(dòng)洗板機(jī)（可選擇）
5)酶標(biāo)儀和數(shù)據(jù)分析軟件
2.試劑準(zhǔn)備：
1)Standards‐標(biāo)準(zhǔn)品
將Standard A用Incubation Buffer按照2倍梯度往下稀釋5個(gè)點(diǎn)(Standard A‐E)，Standard F為Incubation Buffer，即零濃度。
2)Biotinylated P1NP Antigen‐生物素標(biāo)記的P1NP抗體
將其按照1:100稀釋于Incubation Buffer中（現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫下靜置10分鐘，混合均勻后使用。
3)POD Conjugated Antibody‐酶結(jié)合物
將其按照1:100稀釋于Incubation Buffer中（現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫下靜置10分鐘，混合均勻后使用。
4)Washing Solution‐洗液
每瓶沖洗濃縮液按照1:50加入至蒸餾水或去離子水中混勻，室溫下保存。
備注：所有其他試劑可直接使用，但在檢測前應(yīng)將其恢復(fù)至室溫，反復(fù)倒轉(zhuǎn)使其混合均勻。
3. 操作步驟：
1)加入100μl稀釋過的生物素標(biāo)記P1NP抗體于所需數(shù)量的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，蓋上封板膜，在酶標(biāo)板振蕩器(300轉(zhuǎn)每分鐘)上于20‐25°C下孵育30±5分鐘。
2)用稀釋好的洗液洗板5次。
a)自動(dòng)洗板：設(shè)置洗板機(jī)分配每孔至少250μl沖洗液。重復(fù)5次，于吸水紙上用力拍打倒置的板以去除殘留的沖洗液。
b)手工洗板：迅速顛倒倒出孔內(nèi)物。每孔加入250μl沖洗液，迅速甩掉孔內(nèi)洗液，于吸水紙上用力拍打倒置的板以去除殘留的洗液。再重復(fù)此過程4次。
3)加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣本于相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔內(nèi)，每個(gè)做雙孔。然后再用多道移液器向所有微孔內(nèi)加入50μl的incubation buffer（注：該操作應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成以減少誤差）。
4)蓋上封板膜，在酶標(biāo)板振蕩器(300轉(zhuǎn)每分鐘)上于20‐25°C下孵育60±5分鐘。
5)用稀釋好的沖洗緩沖液洗板5次。
6)加入100μl新鮮配制的酶結(jié)合物溶液
7)蓋上封板膜，在酶標(biāo)板振蕩器(300轉(zhuǎn)每分鐘)上于20‐25°C下孵育60±5分鐘。
8)用稀釋好的沖洗緩沖液洗板5次。
9)用多道移液器于每孔內(nèi)加入100μl TMB底物。
10)蓋上封板膜，在酶標(biāo)板振蕩器(300轉(zhuǎn)每分鐘)上于20‐25°C下孵育15分鐘。
11)用多道移液器于每孔內(nèi)加入100μl終止液。
12)加入終止液后，30分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm（參考650nm）波長處讀取吸光度。