技術文章 / article
如何能把ELISA實驗做好？操作過程中的注意事項！！
2020-06-30 瀏覽次數：2743
1. 試劑盒使用前室溫平衡20-30分鐘
溫度是ELISA結合反應的重要影響因素，為使所有樣本在一致的溫度下反應，實驗前務必將所有的試劑平衡至室溫，包括檢測樣本，避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA檢測結果的不準確。若無該過程，可能導致一些弱陽性樣本出現假陰性。
2. 規范加樣：不規范的移液操作可能帶來0.1%到5%的移液誤差，甚至更高！
a. 移液器定期校準：選擇密封性好質量可靠的吸頭，吸量不準確，直接影響檢測結果；
b. 加樣前，溶液充分混勻，垂直懸空加入液體，避免加在孔壁上，不可產生氣泡；
c. 加樣時避免液體濺出，如有樣本濺出，應用吸水紙輕輕拭干，并做相應記錄；
d. 如果加樣槍漏氣以至于加樣的量不夠，不能用槍吸出再加，做相應記錄實驗；
e. 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個孔顯色時間相同。
3. 標準品的溶解與稀釋，嚴格按說明書要求進行。
a. 粉末標準品短暫離心，讓因運輸沾到管蓋、管壁的標準品沉到管底。
b. 根據瓶標簽加入一定體積的蒸餾水(或說明書溶液），加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解10-30分鐘，讓粉末*溶解。
注意：加水(或說明書溶液）后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待*溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。
4. 標準品和樣本做復孔
復孔的目的在于：可以計算檢測結果平均值，使實驗結果更準確；通過復孔結果對比，評估試劑盒的精密度及實驗中是否存在誤操作；
5. 震蕩操作
a. 孵育過程震蕩，可以加快、加強抗原抗體之間的相互碰撞接觸，使得反應更加*，OD值通常比未震蕩孵育的結果要高；
b. 洗滌過程中震蕩，可以使洗板更干凈，很大程度上降低背景值，同時提高試劑盒檢測的靈敏度。
6. 洗滌操作
a. 手工洗板，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；
b. 機器洗板應經常檢查沖洗頭是否暢通，若被雜物堵塞可用注射器針頭挑出。
c. 扣干后的酶標板應立即加液，不能干板太久。
7. 顯色判斷
說明書中提供的顯色時間僅為經驗，具體時間需隨時注意觀察。通常高濃度的標準品顏色不再變深，S1、S2、S3有明顯梯度，S5有淡藍色，或者標準品S1孔在630 nm的OD值在0.5-0.7、S5孔的OD值達到0.05-0.08，可以終止反應。
8. 檢測
a. 酶標儀使用前務必預熱10-15分鐘，使結果更穩定；
b. 采用雙波長測定吸光值，排除單波長檢測時的測定干擾（樣本的干擾、干擾色等）。一般采用大波長為參考波長，在參考波長630 nm(570 nm)下，檢測物的吸光值小，檢測波長450 nm和參考波長630 nm(570 nm)的吸光值之差可以消除非特異性吸收，雙波長測定，可以大限度的消除指紋、雜質及不透光的物質對酶標儀讀數帶來的誤差，以保證實驗數據的準確度。
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